為完善化學藥品注射劑滅菌和無菌工藝研究及驗證的相關(guān)技術(shù)要求，我中心參考國內(nèi)外監(jiān)管機構(gòu)、GMP及行業(yè)協(xié)會的相關(guān)指南，并結(jié)合國內(nèi)外化學藥品注射劑研發(fā)與生產(chǎn)現(xiàn)狀，組織起草了《化學藥品注射劑滅菌和無菌工藝研究及驗證指導原則》，旨在促進化學藥品注射劑的研究和評價工作。
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國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心
2020年8月3日

化學藥品注射劑滅菌/無菌工藝研究及驗證指導原則

一、概述

無菌藥品是指法定藥品標準中列有無菌檢查項目的制劑和原料藥，一般包括注射劑、無菌原料藥及滴眼劑等。從嚴格意義上講，無菌藥品應(yīng)不含任何活的微生物，但由于目前檢驗手段的局限性，絕對無菌的概念不能適用于對整批產(chǎn)品的無菌性評價，因此目前所使用的“無菌”概念，是概率意義上的“無菌”。特定批次藥品的無菌特性只能通過該批藥品中活微生物存在的概率低至某個可接受的水平，即無菌保證水平（Sterility Assurance Level, SAL）來表征，而這種概率意義上的無菌需通過合理設(shè)計和全面驗證的滅菌/除菌工藝過程、良好的無菌保證體系以及在生產(chǎn)過程中執(zhí)行嚴格的藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）予以保證。

本指導原則主要參考國內(nèi)外相關(guān)技術(shù)指導原則和標準起草制訂，重點對注射劑常用的滅菌/無菌工藝，即濕熱滅菌為主的終端滅菌工藝（terminal sterilizing process）和無菌生產(chǎn)工藝（aseptic processing）的研究和驗證進行闡述，旨在促進現(xiàn)階段化學藥品注射劑的研究和評價工作的開展。本指導原則主要適用于無菌注射劑申請上市以及上市后變更等注冊申報過程中對滅菌/無菌工藝進行的研究和驗證工作，相關(guān)儀器設(shè)備等的驗證及常規(guī)再驗證不包括在本指導原則的范圍內(nèi)。

本指導原則的起草是基于對該問題的當前認知，隨著相關(guān)法規(guī)的不斷完善以及藥物研究技術(shù)要求的提高，本技術(shù)指南將不斷修訂并完善。

二、注射劑濕熱滅菌工藝

（一）濕熱滅菌工藝的研究

1.濕熱滅菌工藝的確定依據(jù)

滅菌工藝的選擇一般按照滅菌工藝選擇的決策樹（詳見附件1）進行，濕熱滅菌工藝是決策樹中首先考慮的滅菌方法。濕熱滅菌法是利用飽和蒸汽、過熱水噴淋等手段使微生物菌體中的蛋白質(zhì)、核酸發(fā)生變性從而殺滅微生物的方法。

注射劑的濕熱滅菌工藝應(yīng)首選過度殺滅法，即F0（標準滅菌時間）值大于12的滅菌工藝；對熱不穩(wěn)定的藥物，可以選擇殘存概率法，即F0值大于8的滅菌工藝。如果F0值不能達到8，提示選擇濕熱滅菌工藝不合適，需要考慮無菌生產(chǎn)工藝。

以上兩種濕熱滅菌工藝都可以在實際生產(chǎn)中使用，具體選擇哪種滅菌工藝，在很大程度上取決于產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性。藥物是否能耐受濕熱滅菌工藝，除了與藥物活性成分的化學性質(zhì)相關(guān)外，還與制劑的處方、工藝、包裝容器等密切相關(guān)，所以在初期的工藝設(shè)計過程中需要通過對藥物熱穩(wěn)定性的綜合分析來確定濕熱滅菌工藝的可行性。

一般而言，需要通過各個方面的研究，使藥物盡可能地可以采用濕熱滅菌工藝。只有在理論和實踐均證明即使采用了各種可行的技術(shù)方法之后，藥物活性成分依然無法耐受濕熱滅菌工藝時，才能選擇無菌保證水平較低的無菌生產(chǎn)工藝。任何商業(yè)上的考慮均不能作為不采用具有最高無菌保證水平的終端滅菌工藝的理由。

1.1藥物活性成分的化學結(jié)構(gòu)特點與穩(wěn)定性

通過對藥物活性成分的化學結(jié)構(gòu)進行分析，可以初步判斷藥物活性成分的穩(wěn)定性，如果其結(jié)構(gòu)中含有一些對熱不穩(wěn)定的化學基團，則提示該藥物活性成分的熱穩(wěn)定性可能較差。在此基礎(chǔ)之上，還應(yīng)該通過設(shè)計一系列的強制降解試驗對藥物活性成分的穩(wěn)定性做進一步研究確認，了解在各種條件下可能發(fā)生的降解反應(yīng)，以便在處方工藝研究中采取針對性的措施，保障產(chǎn)品能夠采用濕熱滅菌工藝。對于一般降解雜質(zhì)，不應(yīng)僅僅因為其含量超過 ICHQ3A、Q3B指導原則規(guī)定的限度，就排除濕熱滅菌工藝而不進行論證，如果一般降解雜質(zhì)確證為代謝產(chǎn)物或其含量水平已經(jīng)過確認在可接受的范圍內(nèi)，仍推薦采用濕熱滅菌工藝。

1.2處方工藝

在對藥物活性成分的化學結(jié)構(gòu)特點與穩(wěn)定性進行研究的基礎(chǔ)上，可以有針對性地進行處方工藝的優(yōu)化研究。例如采用充氮工藝或在處方中加入適宜的抗氧化劑來減少氧化雜質(zhì)的產(chǎn)生；選擇利于藥物活性成分穩(wěn)定的pH值范圍、溶劑系統(tǒng)、輔料等；通過滅菌時間和滅菌溫度的調(diào)整來選擇藥物可以耐受的濕熱滅菌工藝條件等。

1.3 包裝系統(tǒng)

注射劑包裝系統(tǒng)的選擇和設(shè)計也是可能影響濕熱滅菌工藝條件選擇和最終無菌保證水平的重要因素。研究中需要結(jié)合產(chǎn)品特性、包裝系統(tǒng)的相容性、以及滅菌器的滅菌原理等因素，對包裝系統(tǒng)的種類、性狀、尺寸進行篩選，保證所選的滅菌工藝條件不會對包裝系統(tǒng)的密封性和相容性產(chǎn)生不利的影響，如包裝系統(tǒng)的變形、破裂，或者浸出物超過可接受的水平等。應(yīng)該注意的是，使用熱不穩(wěn)定的包裝系統(tǒng)不能作為選擇無菌工藝的理由。

1.4注射劑的穩(wěn)定性研究

無論使用何種設(shè)計方法，都需要進行終端滅菌產(chǎn)品的穩(wěn)定性研究?？疾旖K端滅菌工藝對產(chǎn)品穩(wěn)定性影響的指標可包括有關(guān)物質(zhì)、含量、pH值、顏色以及產(chǎn)品的其它關(guān)鍵質(zhì)量屬性。

滅菌時，微生物的殺滅效果和藥物活性成分的降解程度都是溫度和時間累積作用的結(jié)果。這意味著加熱和冷卻過程的變化也可能影響微生物的殺滅效果和產(chǎn)品的穩(wěn)定性。因此，穩(wěn)定性研究用樣品最好選取處于最苛刻滅菌條件下的產(chǎn)品，如可選取在熱穿透試驗中F0最大或滅菌參數(shù)值（最高允許滅菌溫度和/或最長滅菌時間）最大位置處的滅菌產(chǎn)品進行穩(wěn)定性考察，以確保所有滅菌產(chǎn)品的質(zhì)量在有效期內(nèi)仍能符合要求。

1.5 仿制注射劑滅菌工藝的選擇

仿制注射劑選擇的滅菌/除菌工藝，應(yīng)能保證其無菌保證水平不低于參比制劑。如果參比制劑采用了無菌生產(chǎn)工藝，若仿制注射劑對其處方組成合理性、滅菌工藝產(chǎn)生的降解雜質(zhì)的安全性風險等因素進行了全面的論證之后，也可以采用濕熱滅菌工藝。同時，參比制劑也需要考慮完善工藝。

2. 微生物污染的監(jiān)控

過度殺滅法假設(shè)的微生物污染水平和耐熱性都高于實際值，理論上能完全殺滅微生物，從而能提供很高的無菌保證值，故沒有必要對每一批次產(chǎn)品進行微生物污染水平的監(jiān)控。從控制熱原的角度，建議按照藥品GMP管理，以適當?shù)念l次對微生物污染水平進行監(jiān)測。

與過度殺滅法相比，殘存概率法的熱能較低，為不降低產(chǎn)品的無菌保證水平，除了需要對滅菌過程本身進行嚴格的控制以外，還需要合理的工藝設(shè)計來降低微生物污染，并采用適當?shù)姆椒▽ξ⑸镂廴舅胶湍蜔嵝赃M行監(jiān)測。

2.1 降低滅菌前微生物污染的工藝設(shè)計

在生產(chǎn)工藝各環(huán)節(jié)引入微生物的風險評估基礎(chǔ)上，通?？紤]采用藥液過濾、藥液存放時限控制等方法來降低注射劑滅菌前的微生物污染。雖然藥液過濾在終端滅菌產(chǎn)品的生產(chǎn)中僅僅作為輔助的控制手段，但是在工藝研究過程中，也應(yīng)該對濾膜的孔徑、材質(zhì)、使用周期等基本性質(zhì)進行必要的篩選和驗證，并在工藝操作中進行相應(yīng)的規(guī)定。藥液在制備、分裝過程中易引起微生物繁殖，尤其一些營養(yǎng)型的注射劑，因此應(yīng)通過必要的考察和驗證來確定藥液配制至過濾前、以及過濾、灌裝后至滅菌前能夠放置的最長時限，并相應(yīng)確定產(chǎn)品的批量和生產(chǎn)周期。

2.2 滅菌前微生物污染的監(jiān)測

滅菌前微生物污染水平監(jiān)測的取樣應(yīng)覆蓋正常生產(chǎn)的整個過程，應(yīng)選取生產(chǎn)過程中污染最大，最有代表性的樣品，且要充分考慮到產(chǎn)品從灌封到滅菌前的放置時間。一般而言，如果灌裝需要持續(xù)一段時間，可從每批產(chǎn)品灌裝開始、中間及結(jié)束時分別取樣。滅菌前微生物污染水平監(jiān)測通常采用薄膜過濾法，方法應(yīng)經(jīng)過驗證，具體操作可參照《中國藥典》的“微生物限度檢查法”。

對于滅菌前微生物污染水平監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)有污染菌的產(chǎn)品，應(yīng)采用合適的方法進行污染菌的耐熱性檢查。耐熱性檢查中任何幸存下來或生長的微生物都可以被假定為耐熱菌，一般采用定時煮沸法將它與已知的生物指示劑的耐熱性加以比較，必要時，可進一步測試耐熱污染菌的D值（微生物耐熱參數(shù)，D值的具體檢測方法詳見附件2），然后根據(jù)滅菌的F0值及污染菌的數(shù)量與耐熱性對產(chǎn)品的無菌性做出評價。當產(chǎn)品微生物污染水平超過限度時，應(yīng)對污染菌進行鑒別，調(diào)查污染菌的來源并采用相應(yīng)的糾正措施。

（二）濕熱滅菌工藝的驗證

濕熱滅菌工藝的驗證一般分為物理確認和生物學確認兩部分，物理確認包括熱分布試驗、熱穿透試驗等，生物學確認主要是微生物挑戰(zhàn)試驗。物理確認和微生物挑戰(zhàn)試驗結(jié)果應(yīng)一致，兩者不能相互替代。

1.物理確認

1.1 物理確認的前提

物理確認所用的溫度測試系統(tǒng)應(yīng)在驗證和/或試驗前、后進行校準，校準的頻次應(yīng)根據(jù)儀器設(shè)備的性能、驗證持續(xù)的時間長短來確定。

物理確認所涉及的滅菌設(shè)備，應(yīng)該在滅菌工藝驗證前已通過設(shè)備確認。如果在實施滅菌工藝驗證前已經(jīng)在包含擬驗證工藝條件下完成了空載熱分布試驗，且在驗證合格期限內(nèi)，原則上可以引用相關(guān)數(shù)據(jù)和結(jié)論。

1.2裝載熱分布試驗

裝載熱分布試驗的目的是在擬采用的裝載方式下，考察產(chǎn)品裝載區(qū)內(nèi)實際獲得的滅菌條件與設(shè)計的滅菌周期工藝參數(shù)的符合性。了解裝載區(qū)內(nèi)的溫度分布狀況，包括高溫點（熱點）、低溫點（冷點）的位置，為后續(xù)的評估和驗證提供科學依據(jù)。裝載熱分布一般在空載熱分布的基礎(chǔ)上進行。溫度探頭的個數(shù)和安裝位置應(yīng)綜合滅菌器的幾何形狀、空腔尺寸、產(chǎn)品排列方式以及空載熱分布確認的結(jié)果等要素確定，且至少應(yīng)涵蓋空載熱分布測試獲得的高溫點、低溫點，滅菌器自身溫度測試探頭部位等特殊位置。溫度探頭在該階段測試中應(yīng)固定，且安放在待滅菌容器的周圍，注意不能接觸待滅菌容器或非常接近滅菌器內(nèi)壁。

裝載熱分布試驗需要考慮最大、最小和生產(chǎn)過程中典型裝載量情況，試驗時應(yīng)盡可能使用待滅菌產(chǎn)品。如果采用類似物，應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品的熱力學性質(zhì)等進行適當?shù)娘L險評估。待滅菌產(chǎn)品的裝載方式和滅菌工藝等各項參數(shù)的設(shè)定應(yīng)與正常生產(chǎn)時一致，應(yīng)采用適宜的方式（圖表或照片）描述產(chǎn)品的裝載方式，并評估探頭放置是否合理。每一裝載方式的熱分布試驗需要至少連續(xù)進行三次。

1.3 熱穿透試驗

熱穿透試驗用于考察滅菌器和滅菌程序?qū)Υ郎缇a(chǎn)品的適用性，目的是確認產(chǎn)品內(nèi)部也能達到預定的滅菌溫度、滅菌時間或F0值。一個好的滅菌器和滅菌程序，既要使所有待滅菌產(chǎn)品達到一定的F0值，以保障產(chǎn)品的SAL≤10－6，同時又不能使部分產(chǎn)品受熱過度而造成產(chǎn)品中活性成分的降解，導致同一滅菌批次的產(chǎn)品出現(xiàn)質(zhì)量不均一。

熱穿透試驗的溫度探頭的個數(shù)和采樣位置可參考裝載熱分布設(shè)置，采樣位置的確定應(yīng)基于風險評估的原則，包括熱分布試驗確定的高溫點和低溫點、其他可能的高溫點、滅菌器溫度探頭附近、產(chǎn)品溫度記錄探頭處等。除要求采用足夠數(shù)量的溫度探頭外，還應(yīng)將熱穿透溫度探頭置于藥液中最難或最遲達到滅菌溫度的點，即整個包裝中最難滅菌的位置。對于小容量注射液，如果有數(shù)據(jù)支持或有證據(jù)表明將探頭放在產(chǎn)品包裝之外也能夠反映出產(chǎn)品的滅菌程度，風險能夠充分得到控制，也可以考慮將探頭放在容器之外。

熱穿透試驗的步驟及要求與裝載熱分布試驗基本相同，每一裝載方式的熱穿透試驗也需要至少進行三次。通過熱穿透試驗可以確定在設(shè)定的滅菌程序下，滅菌器內(nèi)各個位置的待滅菌產(chǎn)品是否能夠到達設(shè)定的溫度、時間或F0值。再結(jié)合滅菌前微生物污染水平的檢測，可以確定滅菌器內(nèi)各個位置的待滅菌產(chǎn)品是否能夠達到預期的無菌保證水平。

對于F0值最大點位置的樣品，由于其受熱情況最為強烈，因此應(yīng)評估該位置產(chǎn)品的穩(wěn)定性情況，以進一步確認滅菌對于產(chǎn)品的穩(wěn)定性沒有影響。

1.4 熱分布和熱穿透試驗數(shù)據(jù)的分析處理

在物理確認試驗中，應(yīng)確認關(guān)鍵和重要的操作參數(shù)并有相應(yīng)的文件和記錄。需要關(guān)注的主要參數(shù)可能包括：

- 保溫階段每個探頭所測得溫度的變化范圍

- 保溫階段不同探頭之間測得的溫度差值

- 保溫階段探頭測得的溫度與設(shè)定溫度之間的差值

- 升溫階段探頭測得達到設(shè)定溫度的最短及最長時間

- F0的下限及上限

- 滅菌結(jié)束時的最低F0值

- 保溫階段的最低和最高壓力

- 飽和蒸汽溫度和壓力之間的關(guān)系

- 保溫階段腔室的最低和最高溫度

- 熱穿透溫度探頭之間的最大溫差或F0的變化范圍

- 最長平衡時間

- 最少正常運行的探頭數(shù)

以上參數(shù)的合格標準應(yīng)結(jié)合滅菌條件、滅菌設(shè)備的特點以及產(chǎn)品的實際情況制定。通常情況下，熱分布試驗的保溫時間內(nèi)溫度波動應(yīng)在±1.0℃之內(nèi)。升、降溫過程的溫度波動可通過總體F0值來反映，如果溫度或F0值差別過大，提示滅菌器的性能不符合要求、裝載方式選擇不當?shù)?，需要尋找原因并進行改進，重新進行驗證。另外對于熱敏感的藥物，還應(yīng)該控制滅菌器的升溫和降溫時間，以保證輸入的熱能控制在合理的范圍內(nèi)，不會對產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性造成影響。

2.生物學確認

濕熱滅菌工藝的微生物挑戰(zhàn)試驗是指將一定量已知D值（微生物耐熱參數(shù)）的耐熱芽孢（生物指示劑）在設(shè)定的濕熱滅菌條件下進行滅菌，以驗證設(shè)定的滅菌工藝是否確實能使產(chǎn)品達到預定的無菌保證水平。生物指示劑被殺滅的程度，是評價一個滅菌程序有效性的直觀指標。

2.1生物指示劑選用的一般原則

一般情況下，生物指示劑選擇的原則性要求是：芽孢穩(wěn)定、非致病菌、易于培養(yǎng)、有效期長、保存及使用方便、安全性好。針對具體的滅菌工藝和具體的產(chǎn)品，還應(yīng)注意所用的生物指示劑的耐熱性應(yīng)強于待滅菌產(chǎn)品中的污染菌。

濕熱滅菌工藝常用的生物指示劑有以下幾種，嗜熱脂肪芽孢桿菌，生孢梭菌、枯草芽孢桿菌等。對于采用過度殺滅法的滅菌程序，生物指示劑系統(tǒng)主要是嗜熱脂肪芽孢桿菌的孢子，或其他D值大于1的芽孢。殘存概率法由于其熱輸入量比較低，因此在驗證中使用的生物指示劑的耐熱性可以小于嗜熱脂肪芽孢桿菌。

2.2生物指示劑的使用和放置

實際驗證過程中可以將生物指示劑接種在待滅菌產(chǎn)品中或直接采用市售的生物指示劑成品，殘存概率法推薦采用直接接種法。由于生物指示劑在不同介質(zhì)或環(huán)境中的耐熱性會有所不同，當采用將生物指示劑接種到待滅菌產(chǎn)品的方法時，首先應(yīng)考慮產(chǎn)品對生物指示劑耐熱性的影響。所以對于具體的品種而言，如果需要將生物指示劑接種至產(chǎn)品之中，應(yīng)測定生物指示劑在該產(chǎn)品中的耐熱性，即D值。如果生物指示劑與產(chǎn)品不相容，可以用與產(chǎn)品相似的溶液來代替產(chǎn)品。采用市售的生物指示劑時，如生產(chǎn)企業(yè)不經(jīng)測試直接使用，應(yīng)能提供相應(yīng)證據(jù)，如供應(yīng)商相應(yīng)的質(zhì)量體系認證資質(zhì)、供應(yīng)商質(zhì)量體系的審計報告、相應(yīng)批次產(chǎn)品的檢驗數(shù)據(jù)和報告等，證明生物指示劑的可靠性，以確認測試中使用的生物指示劑的D值是準確的。

生物指示劑的接種量需要根據(jù)生物指示劑在待滅菌樣品中的耐熱性和滅菌工藝條件來確定，應(yīng)符合挑戰(zhàn)性試驗的要求。生物指示劑的接種量可以采用陰性分數(shù)法或者殘存曲線法計算，可以根據(jù)實際情況（如污染菌的耐熱性，擬用的生物指示劑的D值等）選擇合適的計算方法。

裝有生物指示劑的容器應(yīng)緊鄰于裝有測溫探頭的容器，直接接種供試品宜放置在熱穿透試驗產(chǎn)品的緊鄰位置，在滅菌設(shè)備的冷點處必需放置生物指示劑。滅菌器的其他部位應(yīng)裝載產(chǎn)品或者類似物，以盡可能的模仿實際生產(chǎn)時的狀況。

2.3滅菌

生物指示劑的驗證應(yīng)該按照產(chǎn)品設(shè)定的滅菌工藝進行滅菌。每個產(chǎn)品的每個規(guī)格的每一滅菌程序，至少需要連續(xù)進行三次生物指示劑挑戰(zhàn)試驗。

2.4檢查和培養(yǎng)

可以根據(jù)生物指示劑的生長特性以及驗證時的接種方式，采用適當?shù)姆椒ㄟM行檢查和培養(yǎng)。完成滅菌后，盡快將挑戰(zhàn)指示劑放入培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。需要注意不同的生物指示劑所需要的培養(yǎng)條件也各不相同，應(yīng)根據(jù)所用生物指示劑的特性和供應(yīng)商的說明書來確定培養(yǎng)條件，同時應(yīng)放置陽性對照樣品。

2.5試驗結(jié)果的評價

根據(jù)生物指示劑的D值和接種量計算產(chǎn)品在滅菌過程中實際達到的SAL值。如果各次驗證的結(jié)果不一致，需要分析原因，采取相應(yīng)的改進措施后重新進行驗證工作。

3.基于風險評估的驗證方案設(shè)計

濕熱滅菌工藝驗證時，如存在不同滅菌器（一般指相同工作和設(shè)計原理的滅菌器）、處方組成、容器規(guī)格、裝量、裝載方式等情況。在不犧牲無菌保證水平的前提下，為減少驗證試驗數(shù)量，降低驗證成本，可綜合各方面因素考慮，在風險評估的基礎(chǔ)上，通過充分的合理性論證，選用具有代表性的滅菌器、待滅菌產(chǎn)品和裝載方式等進行滅菌工藝驗證，可不必對所有情況進行驗證。

三、注射劑無菌生產(chǎn)工藝

注射劑應(yīng)首選終端滅菌工藝。如經(jīng)充分的研究（包括處方工藝研究、質(zhì)量控制研究等）證實產(chǎn)品無法耐受終端滅菌工藝，則可考慮能否通過除菌過濾工藝進行過濾除菌，如果可以，可采用包含除菌過濾的無菌工藝；如果不可以，則可考慮采用無菌分裝的全無菌工藝。

（一）無菌生產(chǎn)工藝的研究

1.除菌過濾工藝的研究

除菌過濾是指采用物理截留的方法去除液體中的微生物，以達到無菌藥品相關(guān)質(zhì)量要求的過程。采用除菌過濾工藝時，工藝研究和生產(chǎn)過程控制的重點是影響無菌保證水平的工藝步驟和工藝參數(shù)，主要包括物料（如原料藥、輔料、內(nèi)包裝材料等）的質(zhì)量控制、除菌過濾系統(tǒng)的設(shè)計及選擇、除菌過濾工藝參數(shù)的研究、除菌過濾生產(chǎn)過程的控制等。

通常，除菌級過濾器指在工藝條件下每平方厘米有效過濾面積可以截留≥107CFU（colony forming unit，集落/菌落形成單位）的缺陷短波單胞菌（Brevundimonas diminuta，曾用名：缺陷假單胞菌）的過濾器。除菌過濾工藝通常選用0.22μm（更小孔徑或相同過濾效力）的除菌級過濾器。

應(yīng)盡可能采取措施降低除菌過濾的風險，例如：①宜安裝第二只已滅菌的除菌過濾器，最終的除菌過濾濾器應(yīng)當盡可能接近灌裝點；②由于微生物通過除菌過濾器的概率隨著待過濾藥液中微生物數(shù)量的增加而增加，最終除菌過濾前，待過濾藥液的微生物負荷一般小于等于10cfu/100ml；③應(yīng)通過研究確定藥液配制后至過濾前的存放時間、藥液過濾操作的時間、過濾后至灌裝前放置的時間等工藝時限。

除菌過濾器的過濾效能是評價除菌過濾工藝的重要參數(shù)，需要進行相應(yīng)的研究和驗證。通常，影響除菌過濾器的除菌過濾效能的因素包括：①藥液的性質(zhì)，如藥液的粘度、表面張力、pH值、滲透壓等；②過濾步驟的工藝參數(shù)，如過濾的壓力、流速、時間、溫度等；③除菌過濾器與所過濾的藥液的相互作用，如除菌過濾器與藥液的相容性；④除菌過濾器的過濾總量和使用周期等。除菌過濾器的過濾效能可因產(chǎn)品和操作條件不同而不同，濾器的選擇及工藝參數(shù)的研究應(yīng)考慮上述因素。

2.無菌分裝工藝的研究

無菌分裝工藝是指滅菌/除菌工藝處理后的原料藥或者原料藥和輔料，用無菌操作的方法分裝到滅菌后的容器中再進行密封的生產(chǎn)工藝。無菌分裝工藝的工藝研究和生產(chǎn)過程控制的重點同樣是影響無菌保證水平的工藝步驟，主要包括物料（原料藥、輔料、內(nèi)包裝材料等）的質(zhì)量控制、物料暴露于環(huán)境中可能再污染的操作步驟等。

關(guān)于物料的質(zhì)量控制，采用無菌分裝工藝的制劑所涉及的所有物料，都必須采用適當?shù)臏缇?除菌工藝處理后方可使用。各物料的滅菌/除菌工藝，都應(yīng)經(jīng)過驗證、進行監(jiān)測，并受到良好的控制。同時需要對各物料的無菌性、細菌內(nèi)毒素水平等進行嚴格控制，通過研究確定相應(yīng)的質(zhì)控標準。

原料藥或者原料藥和輔料的分裝步驟是影響產(chǎn)品質(zhì)量和無菌保證水平的關(guān)鍵生產(chǎn)步驟，應(yīng)結(jié)合生產(chǎn)設(shè)備和產(chǎn)品特點進行工藝參數(shù)（如分裝速度和分裝時間等）的研究，并確定相應(yīng)的工藝控制標準。

（二）無菌生產(chǎn)工藝的驗證

無菌生產(chǎn)工藝驗證主要包括除菌過濾工藝驗證及無菌工藝模擬試驗。采用除菌過濾工藝的產(chǎn)品應(yīng)進行除菌過濾工藝驗證及無菌工藝模擬試驗，采用無菌分裝工藝的產(chǎn)品應(yīng)進行無菌工藝模擬試驗。

1.除菌過濾工藝驗證

除菌過濾工藝驗證一般包括細菌截留試驗、化學兼容性試驗、可提取物或浸出物試驗、安全性評估和吸附評估等內(nèi)容。應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品特點及實際過濾工藝中的最差條件，對相關(guān)驗證試驗進行合理設(shè)計，具體驗證操作（如細菌截留試驗中挑戰(zhàn)用微生物的選擇、濾膜的要求，可提取物和浸出試驗中的風險評估、提取方式、檢測方法及安全性評估，化學兼容性試驗中應(yīng)重點考察的指標，吸附試驗的試驗條件等）可參照《除菌過濾技術(shù)及應(yīng)用指南》及《化學藥品注射劑生產(chǎn)所用的塑料組件系統(tǒng)相容性研究技術(shù)指南》相關(guān)內(nèi)容進行。其中，結(jié)合產(chǎn)品特點，還應(yīng)關(guān)注的內(nèi)容如下：

1.1 細菌截留試驗中挑戰(zhàn)溶液的選擇

藥品和/或工藝條件本身可能會影響挑戰(zhàn)微生物的存活力，因此在進行細菌截留試驗之前，需要確認挑戰(zhàn)微生物于工藝條件下在藥品中的存活情況（生存性實驗/活度實驗），以確定合理的細菌挑戰(zhàn)方法。對于非殺菌性/非抑菌性的藥液，直接在藥液中接種測試微生物是測試除菌級過濾器細菌截留能力的首選方法；對于抑菌的/殺菌的藥液，可采用修改工藝（如調(diào)整溫度）、修改測試液配方（調(diào)整pH值、去除殺菌成分或使用產(chǎn)品的替代溶液）等方法對過濾器進行預處理后再進行細菌挑戰(zhàn)試驗。如果使用替代溶液進行試驗，需要提供合理的數(shù)據(jù)和解釋。對于同一族產(chǎn)品，即具有相同組分而不同濃度的產(chǎn)品，可以用挑戰(zhàn)極限濃度的方法進行驗證，替代性地接受中間的濃度。

1.2 細菌截留試驗條件的合理性

過濾溫度、過濾時間、過濾批量和壓差或流速等會影響細菌截留試驗的結(jié)果。建議對實際生產(chǎn)的過濾工藝進行一次徹底評估，包括溶劑性質(zhì)（例如水性的、酸、堿、有機的）、過濾時間、工藝壓差、工藝流速、工藝溫度、過濾批量和過濾器設(shè)計規(guī)范，以便合理設(shè)計微生物截留試驗條件。如果細菌截留驗證研究中，在過濾器的下游檢測到測試用微生物，則應(yīng)進行調(diào)查。如果調(diào)查確認測試用微生物能穿透完整性檢測達標的過濾器，那么就應(yīng)重新考慮此種過濾器在這些工作條件下的適用性。

1.3 關(guān)于除菌過濾系統(tǒng)的完整性測試

完整性測試貫穿于細菌截留試驗以及化學兼容性試驗，除此之外，在藥品連續(xù)三批生產(chǎn)工藝驗證及常規(guī)生產(chǎn)過程中也涉及完整性測試。應(yīng)明確過濾器使用后完整性測試的潤濕介質(zhì)（包括水、乙醇等標準介質(zhì)或藥液），如果采用的潤濕介質(zhì)為藥液，則應(yīng)進行產(chǎn)品相關(guān)完整性標準的驗證以支持該標準的確定。對于冗余過濾，使用后應(yīng)先對主過濾器進行完整性測試，如果主過濾器完整性測試通過，則冗余過濾器不需要進行完整性測試；如果主過濾器完整性測試失敗，則需要對冗余過濾器進行完整性測試。對于經(jīng)過驗證需要一系列（兩個或以上）的除菌級過濾器的除菌單元，在使用后必須全部通過完整性測試。

1.4 關(guān)于濾器重復使用時的驗證考慮

過濾器的重復使用對于制藥過程來說通常是不被推薦的，如在實際工作中存在重復使用的情況，應(yīng)進行充分的風險評估，包括細菌的穿透、過濾器完整性缺陷、可提取物的增加、清洗方法對產(chǎn)品內(nèi)各組分清洗的適用性、產(chǎn)品存在的殘留（或組分經(jīng)滅菌后的衍生物）對下一批次產(chǎn)品質(zhì)量風險的影響、過濾器過早堵塞、過濾器組件老化引起的性能改變等，并提供充分的驗證和數(shù)據(jù)支持。

1.5 關(guān)于采用減菌過濾工藝時應(yīng)進行的驗證

減菌過濾通常設(shè)計在終端滅菌工藝生產(chǎn)的無菌制劑的灌裝前端，或非最終滅菌工藝生產(chǎn)的無菌制劑的除菌過濾工序前端。通常采用0.45μm或0.22μm（及以下）孔徑的過濾器。針對減菌過濾應(yīng)進行的驗證包括化學兼容性、可提取物/浸出物及吸附試驗等。

2.無菌工藝模擬試驗

無菌工藝模擬試驗是指采用適當?shù)呐囵B(yǎng)基或其他介質(zhì)，模擬制劑生產(chǎn)中無菌操作的全過程，評價該工藝無菌保障水平的一系列活動。應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品特點及實際工藝中的最差條件，對相關(guān)驗證試驗進行合理設(shè)計，具體驗證操作，包括模擬介質(zhì)的選擇與評價（培養(yǎng)基、其他介質(zhì)）、灌裝數(shù)量及容器的裝量、最差條件的選擇、培養(yǎng)方式、結(jié)果評價等，可參照《無菌工藝模擬試驗指南（無菌制劑）》相關(guān)內(nèi)容進行。同時，應(yīng)重點關(guān)注以下內(nèi)容：

2.1 最差條件及干預操作的代表性

應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品實際生產(chǎn)工藝，評估模擬試驗設(shè)計的最差條件及干預操作是否能夠涵蓋實際生產(chǎn)過程中可能產(chǎn)生的情況。

最差條件并不是指人為創(chuàng)造的超出允許范圍的生產(chǎn)狀況和環(huán)境。為了確認無菌工藝風險控制的有效性，應(yīng)通過風險評估并結(jié)合無菌生產(chǎn)工藝、設(shè)備裝備水平、人員數(shù)量和干預等因素來設(shè)計模擬試驗最差條件。包括但不限于以下方面：1）人員：應(yīng)充分考慮人員及其活動對無菌生產(chǎn)工藝帶來的風險。如模擬生產(chǎn)過程的最多人數(shù)，當操作人員數(shù)量減少可能導致其他方面污染風險增加時，則此類條件也視為最差條件之一。參與人員應(yīng)包括日常參與到無菌生產(chǎn)的全部人員，如生產(chǎn)操作、取樣、環(huán)境監(jiān)測和設(shè)備設(shè)施維護人員，同時應(yīng)考慮以上人員交叉作業(yè)、班次輪換、更衣、夜班疲勞狀態(tài)等因素。2）時限：在條件允許的情況下，適當考慮模擬實際生產(chǎn)操作過程中房間、設(shè)備、物料消毒或滅菌后放置的最長時間及最長的工藝保留時限等，如設(shè)備設(shè)施、分裝容器、無菌器具滅菌后最長的放置時間等。3）灌裝速度/分裝速度：模擬試驗應(yīng)涵蓋產(chǎn)品實際灌裝速度范圍，基于無菌風險的角度分析評價灌裝速度對工藝過程及其他方面的影響程度。例如采用最慢的灌裝速度、最大的容器用以模擬最長暴露時間；或采用最快的灌裝速度、最小的容器時，用以模擬最大操作強度/難度。4）環(huán)境：無菌工藝模擬試驗期間環(huán)境的消毒處理應(yīng)依據(jù)正常生產(chǎn)期間的消毒方法進行，避免過度消毒及消毒劑的過度使用。

干預是指由操作人員按照相關(guān)規(guī)定參與無菌工藝生產(chǎn)的所有操作活動。干預可分為固有干預和糾正性干預。固有干預是指常規(guī)和有計劃的無菌操作，如裝載膠塞、環(huán)境監(jiān)控、設(shè)備安裝等；糾正性干預是指對無菌生產(chǎn)過程的糾正或調(diào)整，如生產(chǎn)過程中更換部件、設(shè)備故障排除等。

2.2 不同形式注射劑無菌工藝模擬試驗

2.2.1 注射液

注射液通常采用培養(yǎng)基溶液進行常規(guī)的無菌工藝模擬試驗。

2.2.2 注射用凍干粉末

注射用凍干粉末的無菌工藝模擬試驗還包括凍干過程的進箱、凍干、出箱操作（冷凍可能會抑制微生物生長，通常不模擬冷凍過程），通常情況下可采用縮短維持時間模式，即培養(yǎng)基灌裝到容器中，半壓塞后將容器轉(zhuǎn)移至凍干機內(nèi)部分抽真空，維持時間短于實際凍干周期，然后箱體破空（可依據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)計破空次數(shù)）后進行壓塞。

2.2.3 注射用無菌粉末

注射用無菌粉末其分裝所用的生產(chǎn)線與常規(guī)液體灌裝線不同，進行無菌工藝模擬試驗時需要將培養(yǎng)基及模擬介質(zhì)均灌裝入容器中，模擬方法通常包括：使用無菌粉末分裝設(shè)備將液體培養(yǎng)基和模擬介質(zhì)進行一步灌裝；加裝特殊設(shè)備灌裝液體培養(yǎng)基；先在線灌裝無菌液體培養(yǎng)基到容器中，然后再在生產(chǎn)線上進行無菌粉末的分裝模擬；先在生產(chǎn)線上進行無菌粉末的分裝，然后再灌裝無菌液體培養(yǎng)基到容器中；或其他方式。應(yīng)根據(jù)具體情況設(shè)計培養(yǎng)基灌裝工藝，并充分說明設(shè)計的合理性。

四、附件

附件1：滅菌工藝選擇的決策樹

附件2：D值的測定方法

D值的測定除了采用耐熱性測試儀以外，還可以采用毛細管暴熱計時法測定污染微生物的耐熱參數(shù)D值。

毛細管暴熱計時法測定主要包括以下幾個步驟：

①制樣：將產(chǎn)品中的微生物分離，將菌膜或者孢子懸浮液分別放入注射用水或者磷酸鹽緩沖液中，采用適宜的設(shè)備振動使其分散均勻，制備成濃度約為108個/ml的懸浮液，然后在沸水中加熱約10分鐘以殺滅可能存在的芽孢繁殖體。

②測定：將上述懸浮液注入適宜長度的毛細管中，使每管的菌量為106個孢子，封口，置于校正過的121℃的油浴中曝熱。每隔1-3分鐘取出兩支毛細管并迅速冷卻，制備孢子溶液，培養(yǎng)后計數(shù)。

③計算：根據(jù)公式lgNt=lgN0-t/D，其中，N0和Nt分別為零時和曝熱t(yī)時間的孢子的濃度。

附件3：生物指示劑用量的確定方法

①陰性分數(shù)法

根據(jù)公式：

F0=ΣL×t，其中L為各個特定溫度下的滅菌率（當參比溫度121℃時，Z=10℃），t為各個特定溫度的持續(xù)時間。

SLR=F0/Dbi，其中SLR為spore log reduction，即孢子對數(shù)下降值，Dbi為所選用的生物指示劑在121℃下的D值。

SLR=lgN0- lgNt  ，其中N0為滅菌前容器內(nèi)初始孢子數(shù)，Nt為滅菌后容器內(nèi)殘存孢子數(shù)。

Nt=2.303×lg(n/q) ，其中n為挑戰(zhàn)性試驗瓶樣品總數(shù)，q為挑戰(zhàn)性試驗結(jié)果為陰性的瓶數(shù)。

可以得到：

lgN0=lgNt +SLR= lg[2.303×lg(n/q) ]+ F0/Dbi  =lg[2.303×lg(n/q)] + ΣL×t /Dbi

當濕熱滅菌工藝確定后，通過滅菌柜的數(shù)據(jù)采集設(shè)備可以自動計算F0值，即ΣL×t值可以確定；生物指示劑確定后，Dbi可以確定；微生物挑戰(zhàn)試驗方案確定后，n、q可以確定。所以，通過以上的幾個公式，可以計算出生物指示劑的用量，即N0。

需要說明的是，生物指示劑的最低接種量通常不得低于105。在常規(guī)的生產(chǎn)條件下，如采用115℃滅菌30分鐘，應(yīng)確保生物指示劑的用量、耐熱性與滅菌工藝F0值相適應(yīng)。

②殘存曲線法

根據(jù)公式：

FT/Dbi = lgN0  +1，其中FT為T滅菌值，即給定Z（Z=10）值下，滅菌程序在溫度T下的等效滅菌時間，F(xiàn)T= F0/L；Dbi為所選用的生物指示劑的D值；N0為滅菌前容器內(nèi)初始孢子數(shù)。

當濕熱滅菌工藝的滅菌溫度確定后，L可以確定；生物指示劑確定后，Dbi可以確定；當F0設(shè)定后，即可計算出生物指示劑的用量，即N0。

五、參考文獻

[1] EU.GMP Annex 1 : Manufacture of Sterile Products(2020).

[2] EMA.Guideline on the sterilisation of the medicinal product,active substance,excipient and primary container(2019).

[3] FDA Guidance for Industry Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing – Current Good Manufacturing Practice.

[4] PDA   Validation of Moist Heat Sterilization Pr0cesses: Cycle Design, Development Qualification and Ongoing Control  Technical Report No. 1 (2007 Revision) of PDA.

[5] PDA Process Simulation Testing for Aseptically Filled Products echnical Report No. 22 (2011 Revision) of PDA.

[6] PDA technical Report No. 44 Quality risk management for aseptic processes(2008).

[7] PDA Sterilizing Filtration of Liquids Report No. 26 (2008 Revision) of PDA.

[8] WHO good manufacturing practices for pharmaceutical products: main principles.

[9] ISO 11138-1  Sterilization of health care products- Biological indicators- Part 1:General requirements.

[10] ISO 11138-3  Sterilization of health care products- Biological indicators- Part 3: Biological indicator for moist heat sterilization processes.

[11]《藥品生產(chǎn)驗證指南》化學工業(yè)出版社，2003.

[12] 藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010年修訂）（衛(wèi)生部令第79號）

[13] 《中國藥典》（2015年版）中國醫(yī)藥科技出版社，2015. 

[14] 國家藥品監(jiān)督管理局.關(guān)于發(fā)布除菌過濾技術(shù)及應(yīng)用指南等3個指南的通告（2018年第85號）

《化學藥品注射劑滅菌和無菌工藝研究及驗證指導原則》（征求意見稿）起草說明

一、起草背景

無菌保證水平是化學藥品注射劑的關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一。近年來國內(nèi)外化學藥品注射劑滅菌和無菌工藝研究和驗證相關(guān)技術(shù)要求已不斷完善。參考美國注射劑協(xié)會（PDA）、歐盟及國家局公布的相關(guān)技術(shù)指南、GMP相關(guān)要求，我中心起草了本指導原則，旨在促進化學藥品注射劑的研究和評價工作。經(jīng)過與行業(yè)專家、行業(yè)協(xié)會、國內(nèi)外制藥企業(yè)代表會議討論，形成征求意見稿。

二、起草內(nèi)容與說明

本指導原則主要內(nèi)容包括概述、注射劑濕熱滅菌工藝、注射劑無菌生產(chǎn)工藝、附件及參考文獻五個部分。

概述部分：對無菌的概念及本指導原則的適用范圍進行了明確。

注射劑濕熱滅菌工藝部分：主要對濕熱滅菌工藝的研究和驗證進行了闡述。滅菌工藝研究應(yīng)關(guān)注濕熱滅菌工藝的確定依據(jù)，過度殺滅法和殘存概率法對微生物污染監(jiān)控要求的差異。滅菌工藝驗證包括物理確認和生物確認兩部分，分別對工藝驗證內(nèi)容和要求進行了說明。

注射劑無菌生產(chǎn)工藝部分：明確了選擇無菌生產(chǎn)工藝的前提條件。對除菌過濾工藝、無菌分裝工藝的概念及工藝研究中的關(guān)注點進行了闡述。針對無菌工藝驗證，主要對除菌過濾工藝驗證及無菌工藝模擬試驗中應(yīng)驗證的項目、相關(guān)操作要求及應(yīng)關(guān)注的問題進行了說明。

對于滅菌工藝研究及驗證，國內(nèi)尚無指導原則進行系統(tǒng)的闡述，所以本指導原則進行了比較全面、詳細的闡述。對于無菌工藝研究及驗證，國家局2018年發(fā)布了《除菌過濾技術(shù)及應(yīng)用指南》、《無菌工藝模擬試驗指南（無菌制劑）》，本指導原則主要從注冊申請角度，強調(diào)結(jié)合注冊申請產(chǎn)品的特點設(shè)計開展工作，各項工作具體要求不再詳細闡述，可以參照國家局2018年發(fā)布的上述文件執(zhí)行。

來源：國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心